免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

但是，在做CoIP实验过程中往往会遇到目的蛋白与抗体轻链（25kDa左右）或者抗体重链（55kDa左右）的分子量接近的情况，导致IP-WB检测时无法判断目的蛋白条带（如上图）。如何解决这种问题，困扰了非常多的小伙伴。其实产生抗体轻重链条带污染的主要原因是因为二抗识别了CoIP产物中一抗抗体（上图红圈所示），导致产生抗体的轻链和重链条带。

下面就给大家介绍一些解决这类问题的方法：

1.  抗体共价偶联到磁珠或者Agarose上——这样在洗脱的时候，抗体就不会被洗到CoIP产物中去（产品推荐：A10003 NHS-Activated Magarose Beads，或者M2001系列Tag-Agarose beads产品）；

2.  一抗直接标记HRP，WB实验过程中不使用二抗——这样就不会发生二抗识别CoIP产物中一抗抗体。（产品推荐：M200系列HRP标记标签抗体）；

3.  使用一款只识别天然构象抗体的二抗——由于WB过程中，CoIP产物中一抗抗体变性，该二抗不会识别产生条带。（产品推荐：AbSmart系列二抗）。

上述3种方法中：购买共价偶联好的Tag-Agarose beads产品或者HRP标记的标签抗体，使用起来很方便，作为实验首选。但是绝大部分一抗是没有HRP标记的或者共价偶联beads的，所以很多实验室在做内源性蛋白Co-IP实验时就会很烦恼，这时候使用避免抗体轻重链的AbSmart系列二抗，就可以有效地解决这类问题。作为内源性蛋白的Co-IP实验的首选。如果有实验室需要针对内源性蛋白进行免疫共沉淀+质谱检测（IP/MS）实验的话，为了排除质谱检测时抗体的干扰。可以选择使用NHS- Activated Magarose Beads来共价偶联一抗，然后做CoIP实验将产物进行质谱检测，这样可以大大提高质谱检出蛋白的数量和修饰位点的灵敏度。

注意：有很多同学买了共价偶联好的Tag-Agarose beads产品，在做CoIP-WB检测的时候，也会出现抗体轻重链。详细了解实验流程后，发现是由于CoIP实验的最后一步（互作蛋白洗脱步骤）操作错误导致，即很多同学在3次PBST洗涤之后，直接就加入WB Loading buffer进行煮样，然后就进行SDS-PAGE上样了。这样操作会导致共价偶联的抗体被分离下来，在WB中出现抗体轻重链的条带。正确的操作应该是：1. 3次PBST洗涤之后，加入50-100ul的PH2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入体积根据实验需求自行调整）；2. 震荡混匀，静置30-60s，离心取上清（磁珠用磁力架）；3. 上清中按照体积比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液为PH9.0的Tris溶液）；4. 后续在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

为了方便大家实验操作，Abmart为大家提供了配置好的洗脱液和中和液产品（货号T10007），该产品也可以作为ProA/G产品的洗脱液和中和液。如果是使用Flag抗体进行CoIP实验，可以使用3*DDDDK多肽（货号T10004）进行洗脱，该产品针对非共价偶联的Flag抗体进行的CoIP实验，一样可以起到避免抗体轻重链污染的问题。

下面给大家分享一个实验结果案例：

有需要的小伙伴，可以关注相关产品信息：

1.Tag-Agarose beads产品

M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

2.避免抗体轻重链二抗产品

AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重链)

AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免轻链)

AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重链)

AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免轻链)

3.HRP标记的tag产品

M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

4.共价偶联Agarose产品

A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads